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不對稱催化是現(xiàn)代合成化學(xué)中制備手性分子的核心技術(shù)。在傳統(tǒng)熱催化中，手性催化劑通過降低反應(yīng)活化能壘，選擇性活化與之結(jié)合的底物，從而實現(xiàn)手性誘導(dǎo)。然而，在光催化反應(yīng)，特別是通過能量轉(zhuǎn)移（EnT）途徑進(jìn)行的反應(yīng)中，一個根本性挑戰(zhàn)在于：在非選擇性的光照條件下，游離于催化劑之外的底物同樣會被激發(fā)，進(jìn)而發(fā)生非手性的背景反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物對映選擇性下降。

盡管通過開發(fā)親和性手性光敏劑或底物發(fā)色團(tuán)活化等策略，已在特定體系中實現(xiàn)了激發(fā)態(tài)的對映選擇性控制，但這些方法通常要求底物的吸收波長與光敏劑有顯著差異。對于吸收光譜與光敏劑重疊或更長的底物，其直接激發(fā)導(dǎo)致的背景反應(yīng)難以避免。

鐘芳銳和吳鈺周團(tuán)隊在前期的研究中，基于基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)構(gòu)建了“三重態(tài)人工光酶”（Nature, 2022, 611, 715，Nature：首例光酶催化對映選擇性[2+2]-環(huán)加成反應(yīng)），利用能量轉(zhuǎn)移活化的空間鄰近依賴性和酶空腔的限域效應(yīng)，實現(xiàn)了能量轉(zhuǎn)移催化吲哚底物的對映選擇性[2+2]環(huán)加成。這類光酶可利用其固有的手性空腔，通過多重非共價相互作用精確排列底物與光敏劑，實現(xiàn)高效的能量轉(zhuǎn)移與優(yōu)異的立體控制，例如用于對映選擇性[2+2]光環(huán)加成反應(yīng)。然而，BpA輔因子的固有吸收范圍（365–390 nm）限制了其應(yīng)用，且對于在此窗口內(nèi)有吸收的底物，背景反應(yīng)問題依然突出。

為解決上述挑戰(zhàn)，本研究從自然界的區(qū)室化概念中獲得靈感，提出了一個集成解決方案：利用蛋白質(zhì)空腔對反應(yīng)體系進(jìn)行物理空間上的分割，創(chuàng)造一個獨(dú)特的、與外部本體溶液分離的封閉酶腔。

·酶腔內(nèi)部（催化區(qū)室）： 在蛋白質(zhì)空腔內(nèi)，遺傳編碼的BpA光敏劑與底物在限域的手性環(huán)境中近距離接近，促進(jìn)高效且受保護(hù)的能量轉(zhuǎn)移過程，實現(xiàn)對映選擇性催化。

·本體溶液（淬滅區(qū)室）： 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域外的溶液中，通過引入精心設(shè)計的三重態(tài)淬滅劑，利用碰撞淬滅機(jī)制抑制游離底物因直接激發(fā)而產(chǎn)生的背景反應(yīng)。

該設(shè)計的核心在于，通過蛋白質(zhì)的物理屏障和理性設(shè)計的淬滅劑，實現(xiàn)“腔內(nèi)外”反應(yīng)路徑的精準(zhǔn)調(diào)控，在促進(jìn)腔內(nèi)手性反應(yīng)的同時，抑制腔外的外消旋路徑。

鐘芳銳教授團(tuán)隊2026年招收有機(jī)合成化學(xué)、生物催化、人工智能背景的博士生和博士后，目前實驗室經(jīng)費(fèi)充足，歡迎感興趣的有志之士直接聯(lián)系鐘老師chemzfr@hust.edu.cn.

1. 概念驗證與光酶庫初篩

研究選取了1-萘酚衍生物1a作為模型底物，因其在300-390 nm的紫外吸收與BpA嚴(yán)重重疊。實驗證實，在365 nm光照下，1a存在顯著的非催化背景反應(yīng)（37%產(chǎn)率），且該反應(yīng)可被氧氣（一種已知的三重態(tài)淬滅劑）有效抑制，表明背景反應(yīng)經(jīng)由底物的三重態(tài)進(jìn)行。

為尋找合適的光酶平臺，研究團(tuán)隊構(gòu)建了一個包含LmrR、CgmR、RamR、QacR、TM1030和tHisF六種不同蛋白質(zhì)骨架、共24個BpA嵌入突變體的光酶庫。在高通量篩選后，發(fā)現(xiàn)基于RamR蛋白的變體，特別是RamR_F155BpA（命名為RamR1.0），在催化1a的[2+2]光環(huán)加成中展現(xiàn)出最優(yōu)的活性和對映選擇性（厭氧條件下37%產(chǎn)率，30% e.e.）。

圖2. 光酶酶庫的構(gòu)建與篩選

2. 三重態(tài)淬滅劑的理性設(shè)計與優(yōu)化

在確認(rèn)RamR1.0的催化能力后，研究系統(tǒng)評估了不同淬滅劑對反應(yīng)的影響。

·氧氣： 在空氣和氧氣氛圍下，反應(yīng)的e.e.值分別提升至34%和46%，印證了區(qū)室化淬滅的概念。然而，氧氣同時引發(fā)了底物和產(chǎn)物的氧化副反應(yīng)，導(dǎo)致質(zhì)量平衡下降。

·常規(guī)小分子淬滅劑： 測試了(E)-1,2-二苯乙烯（TQ1）、2,5-二甲基己-2,4-二烯（TQ2）和苝（TQ3）。盡管TQ1和TQ2能提升e.e.值，但它們嚴(yán)重抑制了轉(zhuǎn)化率，推測是由于這些疏水性小分子可自由進(jìn)入酶腔，干擾了內(nèi)部的EnT過程。

·定制化淬滅劑： 為克服上述限制，團(tuán)隊設(shè)計了(E)-4-苯乙烯基苯甲酸（TQ4）。在反應(yīng)pH條件下，TQ4的羧基處于去質(zhì)子化狀態(tài)，帶負(fù)電。由于RamR活性中心入口周圍富集了多個帶負(fù)電荷的酸性氨基酸殘基（如Glu129, Asp132等），靜電排斥作用阻止了TQ4進(jìn)入酶腔，使其能夠選擇性地淬滅溶液中的激發(fā)態(tài)底物。實驗結(jié)果證實，TQ4在顯著提升對映選擇性的同時，保持了良好的反應(yīng)性和質(zhì)量平衡。

·大分子淬滅劑： 進(jìn)一步合成了二苯乙烯功能化的牛血清白蛋白（BSA-TQ1），利用其巨大的分子尺寸實現(xiàn)空間排斥，同樣取得了成功。

瞬態(tài)吸收光譜分析為區(qū)室化保護(hù)提供了直接證據(jù)：RamR1.0-BpA的激發(fā)態(tài)壽命在氧氣存在下幾乎不變，而游離BpA的壽命則被氧氣顯著淬滅，表明蛋白質(zhì)空腔有效保護(hù)了內(nèi)部光敏劑免受外部淬滅劑的影響。

圖3. 三重態(tài)淬滅劑的概念驗證

3. 蛋白質(zhì)工程與催化性能提升

以RamR1.0為起點(diǎn)，研究團(tuán)隊通過聚焦半理性定點(diǎn)飽和突變對其進(jìn)行了定向進(jìn)化?；赗amR的晶體結(jié)構(gòu)和分子對接模擬，對底物結(jié)合口袋周圍的12個殘基進(jìn)行突變，最終獲得了最優(yōu)變體RamR3.0（F155BpA/K63R/S67W/S134A）。

RamR3.0與底物1a的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（分辨率2.50 ?）揭示了其高選擇性機(jī)制：BpA光敏劑與底物萘環(huán)之間的距離為5.7 ?，確保了高效的三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移。突變殘基R63與底物的芐基形成π-陽離子相互作用。突變殘基A134與底物的萘基形成π-烷基相互作用。此外，底物還與T55、A110、V138、D152、L156、M184等多個殘基存在廣泛的非共價相互作用網(wǎng)絡(luò)，包括C-H…π、π-硫、π-σ和π-烷基作用。底物的芐基與BpA之間存在π-π堆積作用。這些相互作用共同將底物穩(wěn)定在特定構(gòu)象，使其烯烴側(cè)鏈優(yōu)先接近萘環(huán)的一個對映異位面，從而實現(xiàn)了高度的立體控制。在TQ4存在下，RamR3.0催化模型反應(yīng)的產(chǎn)率達(dá)70%，對映選擇性高達(dá)94% e.e.。

圖4 人工光酶的定向進(jìn)化和晶體解析

4. 底物普適性與策略通用性

研究考察了RamR3.0-TQ4體系對多種1-萘酚及2-萘酚衍生物的適用性。結(jié)果表明，帶有不同電性取代基的底物、酚酯、芐酯同系物、含氮雜環(huán)底物以及更具挑戰(zhàn)性的萘基酮類底物，在該體系下大多能以良好至優(yōu)秀的產(chǎn)率和對映選擇性（多數(shù) >90% e.e.）得到相應(yīng)的環(huán)加成產(chǎn)物。淬滅劑TQ4在所有案例中均一致地提升了產(chǎn)物的立體化學(xué)純度。

圖5. 底物普適性

該區(qū)室化策略被證明具有廣泛的通用性：成功應(yīng)用于基于噻噸酮輔因子的人工光酶（CMP4.0）催化的環(huán)加成反應(yīng)。在間歇反應(yīng)和連續(xù)流光反應(yīng)器中均能穩(wěn)定運(yùn)行。在克級規(guī)模的流動化學(xué)合成中，產(chǎn)物2m以98%的分離產(chǎn)率和91% e.e.獲得，展示了其應(yīng)用于規(guī)模化合成的潛力。實現(xiàn)了全細(xì)胞光生物催化。在表達(dá)RamR光酶的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，盡管胞內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，仍能成功實現(xiàn)1m的光環(huán)加成，獲得73%產(chǎn)率和82% e.e.。添加TQ4后，對映選擇性進(jìn)一步提升，且細(xì)胞在光照后仍保持高活性（存活率>97%），證明了該策略在生命體系中的適用性。

圖6. “空間分區(qū)“光酶催化策略的通用性和兼容性

本研究成功開發(fā)了一種生物催化“區(qū)室化”策略，通過整合人工三重態(tài)光酶與定制的三重態(tài)淬滅劑，有效解決了不對稱能量轉(zhuǎn)移催化中的外消旋背景反應(yīng)這一關(guān)鍵科學(xué)問題。該工作不僅拓展了人工光酶的工具箱，更重要的是展示了一種通過物理空間分區(qū)來精準(zhǔn)控制光化學(xué)反應(yīng)路徑的創(chuàng)新范式。隨著合成生物學(xué)與蛋白質(zhì)工程技術(shù)的不斷發(fā)展，這種將生物區(qū)室化優(yōu)勢與合成化學(xué)理性設(shè)計相結(jié)合的策略，有望在復(fù)雜手性分子的綠色合成、生物相容性光化學(xué)以及細(xì)胞內(nèi)的精準(zhǔn)合成生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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