產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌(CPE)是一種革蘭氏陰性菌,它可通過(guò)位于細(xì)菌細(xì)胞間質(zhì)的碳青霉烯酶有效水解碳青霉烯類(lèi)抗生素的C-N鍵(如亞胺培南,美羅培南,厄他培南等),繼而導(dǎo)致這些藥物失效,使臨床抗感染治療陷入無(wú)藥可用的危機(jī)。同時(shí)因?yàn)榇蠖鄶?shù)碳青霉烯酶基因位于質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可轉(zhuǎn)移性基因元件上,可導(dǎo)致耐藥基因在不同菌種間快速傳播,誘發(fā)醫(yī)院內(nèi)感染或爆發(fā)流行。鑒于其高感染率、高致死率和高傳播性,CPE已成為當(dāng)今全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅之一。酶的活性受其細(xì)胞內(nèi)生理環(huán)境的精細(xì)調(diào)控,因此,評(píng)估天然細(xì)胞環(huán)境中碳青霉烯酶的酶促反應(yīng)對(duì)于獲得其準(zhǔn)確催化活性信息以及早期疾病檢測(cè)至關(guān)重要。
圖1.(a)實(shí)驗(yàn)流程示意圖。(b)用亞胺培南或緩沖液滴定活KPC-Kp懸液的反應(yīng)熱譜圖。 (c)用亞胺培南滴定陰性細(xì)菌懸液(ESBL-Kp和AmpC-Kp)和KPC蛋白的熱譜圖。(d)EDTA或舒巴坦對(duì)KPC-Kp水解亞胺培南熱譜曲線的影響。
由于任何酶促化學(xué)反應(yīng)都伴有一定的熱量吸收或釋放,并且熱量的變化速率和酶催化速率成正比,因而反應(yīng)量熱法可以為監(jiān)測(cè)天然底物與酶的反應(yīng)進(jìn)程提供一種普適、有力的研究工具。又因?yàn)榱繜岱ㄒ策m用于溶劑不透明或混濁的溶液,為復(fù)雜體系內(nèi)研究酶活提供了可能。如圖1所示,作者通過(guò)比較產(chǎn)KPC 酶肺炎克雷伯菌懸液(KPC-Kp)與純化的KPC 酶溶液(A類(lèi)碳青霉烯酶)水解亞胺培南過(guò)程中的熱譜曲線證實(shí)了細(xì)胞量熱法(in cell-calorimetry)的可行性。進(jìn)一步,作者觀察到用KPC-Kp所得到的熱量變化可以被A類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑舒巴坦完全抑制,而B類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑EDTA對(duì)其沒(méi)有影響,證實(shí)熱變化曲線可以特異性地反映亞胺培南在活細(xì)菌中被水解的過(guò)程。
圖2. OXA-48型碳青霉烯酶催化亞胺培南(IMI)具有“雙相動(dòng)力學(xué)”特征。補(bǔ)充CO2對(duì)(a)量熱法中OXA-48-Kp懸液和(b)紫外光譜法中OXA-48-Kp裂解上清液水解亞胺培南的催化活性的影響。
隨后作者揭示了OXA-48型碳青霉烯酶的熱譜曲線具有特異的“雙相動(dòng)力學(xué)”特征(圖2)。該特征隨NaHCO3濃度的提高而消失,證實(shí)OXA-48酶在催化過(guò)程中其活性中心的賴(lài)氨酸會(huì)發(fā)生去羧基化,進(jìn)一步導(dǎo)致酶在催化過(guò)程中失活,該特征可以作為特征“指紋”圖譜用于攜帶OXA-48細(xì)菌的特異性檢測(cè)。同時(shí)作者對(duì)比了量熱法和紫外分光光度法檢測(cè)OXA-48型碳青霉烯酶水解活性的譜圖,發(fā)現(xiàn)量熱法可以更靈敏地揭示催化過(guò)程中反應(yīng)速率的變化,因此在研究這種特殊的反應(yīng)機(jī)理方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。
圖3.比較了分別使用(a)量熱法和(b)Carba-NP法檢測(cè)產(chǎn)KPC碳青霉烯酶活細(xì)菌的靈敏度。
接著,作者對(duì)量熱法檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的靈敏度做了測(cè)試,并將其與臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的Carba NP方法進(jìn)行了比較(圖3)。結(jié)果表明細(xì)胞量熱法可以準(zhǔn)確檢測(cè)所有臨床常見(jiàn)的碳青霉烯酶,檢測(cè)下限為3-19 nM碳青霉烯酶(106-108 細(xì)菌)。該結(jié)果比Carba NP方法檢測(cè)靈敏度至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。
圖4. 細(xì)胞量熱法檢測(cè)142株臨床細(xì)菌的結(jié)果及其與其它方法的對(duì)比。碳青霉烯酶陽(yáng)性樣品標(biāo)記為“+”,碳青霉烯酶陰性樣品標(biāo)記為“ - ”。紅色虛線表示細(xì)胞量熱法的檢測(cè)閾值。
作者最后對(duì)細(xì)胞量熱法在CPE快速檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了驗(yàn)證(圖4)。實(shí)驗(yàn)采用了來(lái)自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院分離的142株臨床細(xì)菌作為樣品,分別采用細(xì)胞量熱法、Carba NP方法、mCIM法、MHT法和MIC法進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞量熱法具有最佳檢測(cè)靈敏度(97%)和特異性(100%),在檢測(cè)時(shí)間方面也具有明顯優(yōu)勢(shì)(10分鐘內(nèi)),有望應(yīng)用于臨床耐藥細(xì)菌的快速檢測(cè)。
總結(jié):本文報(bào)道了一種基于碳青霉烯酶催化底物過(guò)程中的“熱信號(hào)”變化來(lái)特異性、實(shí)時(shí)、原位跟蹤細(xì)胞內(nèi)酶活的實(shí)驗(yàn)方法,并證明了該技術(shù)在新型催化機(jī)理和快速鑒定臨床CPE方面的應(yīng)用。由于細(xì)胞量熱法概念簡(jiǎn)單,易于應(yīng)用于復(fù)雜生物體系(例如,腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和囊泡等),因而具有廣泛應(yīng)用前景。
通訊作者介紹
和媛,女,化學(xué)博士,西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院副教授,碩士研究生導(dǎo)師,第八批“陜西省百人”。 2011年獲得英國(guó)約克大學(xué) (the University of York) 博士學(xué)位,2011-2013年分別在加拿大Simon Fraser University(David Vocadlo 教授實(shí)驗(yàn)室)和美國(guó)斯克利普斯研究所 (The Scripps Research Institute; Jim Paulson 教授實(shí)驗(yàn)室) 進(jìn)行博士后研究,2013年加入西北大學(xué)。和媛副教授課題組主要從事疾病相關(guān)靶酶反應(yīng)機(jī)理及活性調(diào)控研究,主要研究手段包括:X-射線晶體衍射、酶學(xué)、等溫滴定微量熱(ITC)等。研究成果發(fā)表在包括Angewandte Chemie, JACS, Nature Structural & Molecular Biology, Nature Chemical Biology 等在內(nèi)的著名國(guó)際期刊?,F(xiàn)主持國(guó)家自然科學(xué)基金和陜西省擇優(yōu)資助項(xiàng)目。
徐紀(jì)茹,女,醫(yī)學(xué)博士,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教授、博士研究生導(dǎo)師,陜西省“三秦人才”。1982年獲西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位,1990年獲西安醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位,2001年獲得英國(guó)貝爾法斯特Ulster大學(xué)博士學(xué)位,2004年聘為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教授。主要研究方向:1. 正常菌群與宿主的依存關(guān)系;2. 感染性疾病的分子診斷;3. 細(xì)菌耐藥基因研究。共發(fā)表論文100余篇,培養(yǎng)博士和碩士研究生30余名。主要社會(huì)任職:1. 中國(guó)微生物學(xué)會(huì)真菌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)委員;2.中國(guó)微生物學(xué)會(huì)微免專(zhuān)業(yè)委員會(huì)委員;3. 陜西省微生物學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng);4. 陜西省醫(yī)學(xué)會(huì)微生物學(xué)與免疫學(xué)分會(huì)副主任委員。
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