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在過去的幾年里，化學(xué)發(fā)光已經(jīng)成為一種很有前途的傳感和成像工具，其不需要外部光源的實(shí)時(shí)激發(fā)，因此幾乎不存在自熒光干擾，可以實(shí)現(xiàn)極高的信號背景比，提高體內(nèi)成像的靈敏度。而γ-谷?；?/span>轉(zhuǎn)肽酶(GGT)是一種蛋白酶，參與許多重要的生理過程，許多疾病與GGT活性異常密切相關(guān)。血清GGT活性測定是臨床血液檢測的常規(guī)方法。此外，許多惡性腫瘤也發(fā)現(xiàn)GGT過表達(dá)。因此，準(zhǔn)確測量GGT活性并顯示其位置對疾病診斷和癌癥治療具有重要意義。

Shabat和Lippert等人對Schaap（一類經(jīng)典的化學(xué)發(fā)光分子）的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了合理的修飾，使其在生理?xiàng)l件下與感興趣的生物分子相互作用時(shí)發(fā)出強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光。在此，作者使用修改過的Schaap開發(fā)了第一個(gè)由GGT激活的化學(xué)發(fā)光探針1，該探針可以高靈敏度和特異性檢測血清、腫瘤細(xì)胞和小鼠中的GGT活性。GGT激活的化學(xué)發(fā)光探針的總體設(shè)計(jì)如圖1所示，由一個(gè)與GGT響應(yīng)可斷裂的底物氨基酸γ-Glu、一種高度自發(fā)光的丙烯基取代的苯氧基二氧乙烯發(fā)光體和一個(gè)連接物對氨基芐醇(PABA)組成。γ-Glu是一個(gè)特定的GGT底物,被廣泛應(yīng)用于設(shè)計(jì)各種針對GGT的探針。丙烯基取代的苯氧基二氧乙烯具有高化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率，可以在生理?xiàng)l件下于體內(nèi)有明亮的黃綠色化學(xué)發(fā)光成像。使用PABA連接γ-Glu和發(fā)光體，可以有助于減小探測器的位阻，促進(jìn)其與GGT的活性位點(diǎn)的相互作用。GGT斷裂底物氨基酸γ-Glu后，探針1轉(zhuǎn)換成中間體2。之后又經(jīng)歷自發(fā)的消除過程和去質(zhì)子化，以及破壞過氧化物鍵，最終產(chǎn)生熒光產(chǎn)物5，并伴有約540 nm處的發(fā)光。因此，可以通過GGT選擇性地開啟亮黃綠色的化學(xué)發(fā)光，從而檢測活細(xì)胞和老鼠體內(nèi)的GGT活性。

圖1.GGT活化的化學(xué)發(fā)光探針1的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及化學(xué)轉(zhuǎn)化。（圖片來源：Anal. Chem.）

作者首先研究了探針1在GGT酶的緩沖液中對GGT的反應(yīng)。探針1最初在350 nm處有微弱的紫外吸收和微弱的熒光。與GGT孵育6小時(shí)后，在約400  nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收帶，并伴隨著約540 nm處的強(qiáng)熒光發(fā)射。反應(yīng)液的吸收光譜和熒光光譜與化合物5相同，隨后的HPLC分析表明，探針1 (HPLC保留時(shí)間，TR = 10.4 min)幾乎完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物5 (TR = 7.0 min)。然后作者測量了GGT孵育前后探針1的化學(xué)發(fā)光發(fā)射光譜。探針1本身無化學(xué)發(fā)光，但30 min后，在540 nm波長處觀察到明顯的化學(xué)發(fā)光，且最大發(fā)射值為540 nm。GGT誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光率約為876倍。GGT孵育后探針的化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線顯示信號迅速增加，在30 min左右達(dá)到最大值。相比之下，沒有GGT時(shí)，探針1在測量過程中幾乎沒有化學(xué)發(fā)光。這些結(jié)果表明，GGT可以有效地激活探針1，產(chǎn)生顯著的化學(xué)發(fā)光。

圖2. (a) 酶緩沖液中GGT孵育前(實(shí)線)和孵育后(虛線)探針1的紫外吸收(黑色)和熒光光譜(紅色)。(b)用高效液相色譜法對GGT孵育前(黑色)和孵育后(紅色)的探針1進(jìn)行分析。(c) GGT孵化之前(黑色)和之后(紅色) 探針1的化學(xué)發(fā)光光譜和圖像。(d)加或不加GGT孵育后探針1的化學(xué)發(fā)光動力學(xué)特征。（圖片來源：Anal. Chem.）

在證實(shí)探針1對GGT的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)后，下一步檢測了探針檢測GGT的敏感性。不同濃度GGT孵育探針1，可以看出隨著GGT濃度的增加，化學(xué)發(fā)光圖像變亮，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與GGT濃度呈良好的線性關(guān)系。接下來，作者測試了探針1對GGT的特異性，當(dāng)探針1與其它酶或ROS孵育時(shí)，化學(xué)發(fā)光變化不大，說明探針是GGT的特異性化學(xué)發(fā)光探針。然后，作者使用探針1測定了脂多糖處理前后小鼠血清中GGT的活性（據(jù)報(bào)道，用從革蘭氏陰性菌壁中純化的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)處理小鼠，可引起感染性肝功能障礙）。用未處理的小鼠血清孵育后，探針1的平均化學(xué)發(fā)光量為599 ± 125 (RLU)，據(jù)此計(jì)算健康小鼠血清中GGT的平均活性估計(jì)為1.6 U/L。用LPS處理小鼠時(shí)，血清中GGT水平為3.8  U/L，是正常血清的2.4倍。這些結(jié)果與用于GGT的商用熒光探針AMC-Glu的測量結(jié)果一致，表明探針1用于GGT檢測的可靠性。

圖3.(a)不同濃度GGT孵育后探針1的化學(xué)發(fā)光圖像。(b)平均化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與GGT濃度的線性擬合曲線。(c)探針1對GGT的特異性響應(yīng)。(d) 1號探針在血清中孵育的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。(e)根據(jù)(d)中的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度定量血清中GGT活性。（圖片來源：Anal. Chem.）

然后用GGT過表達(dá)的OVCAR5和U87MG癌細(xì)胞與探針1孵化，顯示化學(xué)發(fā)光逐漸增強(qiáng)。最強(qiáng)信號出現(xiàn)在15 min,可持續(xù)45 min。在60 min時(shí)，與HUVEC細(xì)胞相比，OVCAR5和U87MG腫瘤細(xì)胞中的化學(xué)發(fā)光圖像更亮。OVCAR5和U87MG腫瘤細(xì)胞的平均化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分別是HUVEC細(xì)胞的29倍和23倍。這些結(jié)果表明探針1是有效的，可以實(shí)時(shí)檢測GGT在活細(xì)胞中的活動，從而不僅可以區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，也可以在不同腫瘤細(xì)胞系通過敏感的化學(xué)發(fā)光成像區(qū)分GGT水平。

圖4.(a) 活細(xì)胞與探針1孵化后實(shí)時(shí)測量的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度 (b) 細(xì)胞板的化學(xué)發(fā)光圖像。(c) OVCAR5細(xì)胞的熒光成像。（圖片來源：Anal. Chem.）

受探針1在活腫瘤細(xì)胞中檢測內(nèi)源性GGT的高敏感性啟發(fā)，作者隨后研究了通過GGT活性的化學(xué)發(fā)光成像在體內(nèi)和體外測定OVCAR5細(xì)胞數(shù)量的能力。不同數(shù)量的OVCAR5細(xì)胞與探針1孵化30 min，細(xì)胞數(shù)越多，亮度越大，發(fā)光強(qiáng)度與孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量之間存在良好的線性關(guān)系。接下來，作者研究了在體內(nèi)檢測OVCAR5細(xì)胞數(shù)量的能力。不同數(shù)量的OVCAR5細(xì)胞和探針1皮下注射到老鼠體內(nèi)，30 min后獲取全身化學(xué)發(fā)光圖像。注射部位的化學(xué)發(fā)光信號隨細(xì)胞數(shù)量線性增加。說明探針1對活體小鼠中OVCAR5細(xì)胞數(shù)量的檢測也是可行的。

圖5.用探針1在體內(nèi)外檢測OVCAR5腫瘤細(xì)胞，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度以及OVCAR5細(xì)胞數(shù)量的線性擬合曲線。（圖片來源：Anal. Chem.）

總結(jié)：南京大學(xué)葉德舉課題組合成了一種GGT活化的化學(xué)發(fā)光探針，并證明了其在體內(nèi)外檢測GGT活性的潛力。研究表明，探針在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定，和GGT在水溶液中反應(yīng)后在540 nm出現(xiàn)強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，可以高敏感性和特異性測定用LPS處理過的小鼠血清中的GGT水平。且該探針在體外和活體小鼠體內(nèi)都可以檢測到GGT相關(guān)的腫瘤細(xì)胞，敏感性比熒光成像有了很大的提高。在未來，該探針可以作為一種化學(xué)發(fā)光檢測手段，用于臨床血液樣本中GGT活性的檢測，以及研究活體受試者中與GGT相關(guān)的生理和病理過程。

撰稿人：馮虹