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獲獎人簡介：

Emmanuelle Charpentier博士，法籍微生物學家，現(xiàn)為德國馬克斯·普朗克研究所感染生物學研究所所長。在CRISPR的發(fā)展中，其主要的貢獻在于發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的活性仰賴tracrRNA。

Jennifer A. Doudna博士，為伯克利大學化學和分子生物學與細胞生物學教授，霍華德休斯醫(yī)學研究所的研究員，美國國家科學院院士。她與Emmanuelle Charpentier博士共同發(fā)現(xiàn)Cas9 的切割作用和，crRNA 的定位作用，并將crRNA與tracrRNA可以融合成單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）。

相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜曳治龇Q，華人科學家張鋒首先在真核細胞內(nèi)采用CRISPR-Cas9實現(xiàn)基因編輯，但他未能獲獎，可能是因為張鋒的工作原創(chuàng)性要低一些，他的貢獻更像當初細胞重組中科恩和伯耶的貢獻（1980年化學獎當年人工重組給的是伯格）；而且化學獎更注重體外實驗結(jié)果，他的突破主要體現(xiàn)在細胞方面。

CRISPR已經(jīng)是目前生物醫(yī)學方面非常普及的的基因編輯技術(shù)，近幾年該技術(shù)的飛速發(fā)展，推廣應(yīng)用到了生物、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等多個領(lǐng)域，造就了一批批科研奇跡，尤其是在遺傳病的治療、疾病相關(guān)基因的篩查與檢測、腫瘤治療以及動植物的改造、病原微生物防治等領(lǐng)域有著巨大的潛力，也將深遠地影響整個世界。

1. 什么是CRISPR

CRISPR的全稱是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，中文翻譯為“規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)”。這個詞的字面意思就是“代表了同一類特征明顯、排列整齊、秩序一致的重復(fù)序列”。它作為細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，當外源病毒或質(zhì)粒DNA進入細胞時，專門的Cas蛋白會將外源DNA剪成小片段，并將它們粘貼到自身的DNA片段中存儲。當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據(jù)存儲的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效^[1]。

科學家利用CRISPR的這一功能，將其改造成為一種革命性的新型分子工具。由于它具有精準的定位和切割任何種類的遺傳物質(zhì)的能力，使得科學家能夠更得心應(yīng)手地破解地球上任何生物 (包括人類) 的生命密碼。

2. CRISPR 簡史

圖1：CRISPR發(fā)展簡史

CRISPR的發(fā)現(xiàn)與命名

早在1987年，日本大阪大學的Nakata研究組在分析大腸桿菌時就發(fā)現(xiàn)，細菌中存在一些異常重復(fù)的序列^[2]。但當時人們并不知道這些重復(fù)序列究竟有什么作用，甚至還沒有正式為這些重復(fù)序列命名。直到20世紀80年代末，西班牙阿利坎特大學的Francisco Mojica再次在一種古菌種發(fā)現(xiàn)了類似的重復(fù)序列^[3]，這引起了他極大的興趣。在隨后的研究中，他一直在微生物中尋找類似結(jié)構(gòu)，到2000年他已經(jīng)在20多種不同的微生物種中發(fā)現(xiàn)了這一類似的序列^[4]。2002年，荷蘭烏得勒支大學的Ruud Jansen發(fā)現(xiàn)不同物種的重復(fù)序列堿基數(shù)存在巨大差異，并且這種序列僅存在于原核生物中。為了更好地規(guī)范相關(guān)的研究，他們共同為這種重復(fù)序列命名為“CRISPR”。。多個CRISPR相關(guān)基因則被命名為Cas（CRISPR-associated）家族^[5]。

CRISPR-CAS系統(tǒng)的生物學作用

2005年，CRISPR研究迎來了一個重要發(fā)現(xiàn)，兩個研究小組（Mojica和Pourcel）都觀察到了CRISPR重復(fù)序列之間的間隔序列并非來自于原核生物自身，而是來源于質(zhì)?；虿《?sup>[6-7]。因此，Mojica提出CRISPR是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的假設(shè)。同年，Bolotin研究組在嗜熱鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了Cas9，并預(yù)測這個龐大的蛋白質(zhì)具有核酸酶活性。他們還發(fā)現(xiàn)與病毒同源的間隔序列都具有一種類似的尾巴，稱為PAM（protospacer adjacent motif）序列，它們對靶序列的識別至關(guān)重要。

受到這一假說的激發(fā)，當時還在著名的酸奶公司Danisco工作的法國微生物學家Rodolphe Barragou決定對其進行驗證，以解決嗜熱鏈球菌爆發(fā)噬菌體感染死亡而影響酸奶生產(chǎn)的問題。2007年，他們通過實驗證明CRISPR系統(tǒng)確實是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。嗜熱鏈球菌被病毒入侵后，整合了來自噬菌體基因組新的間隔序列，同樣的病毒再次入侵時細菌就有了抵抗攻擊能力^[8]而Cas9蛋白可能是產(chǎn)生這種免疫能力所必需的。這是首次在實驗上證實了CRISPR-Cas是一種細菌獲得性免疫系統(tǒng)。

CRISPR-CAS的作用機制證實

CRISPR-CAS生物學功能的證實，使得許多研究團隊認識到這一系統(tǒng)的重要性，隨后許多研究團隊紛紛開始補充CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾噬菌體機制的細節(jié)。2008年，John van der Oost研究小組在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，來自噬菌體的間隔序列被轉(zhuǎn)錄成小RNA，成為CRISPR RNA（crRNA），并引導(dǎo)Cas蛋白到靶DNA上。Marraffini和Sontheimer在同年證明了CRISPR-Cas系統(tǒng)的目標分子是DNA，而不是RNA。他們還明確指出，如果將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到非細菌系統(tǒng)中，可能成為一種強大的工具系統(tǒng)^[9-10]。這為隨后的基因編輯埋下了伏筆。

2010年12月，Moineau團隊證明了CRISRP-Cas9在PAM序列上游位置的精確切割使DNA雙鏈斷裂。而作為II型CRISPR系統(tǒng)的顯著特征，Cas9是切割唯一需要的蛋白，它與crRNAs共同介導(dǎo)CRISPR-Cas9的干擾功能^[11]。

2011年，Charpentier研究組對釀膿鏈球菌進行了小RNA測序，發(fā)現(xiàn)除了crRNA以外，還存在一種小RNA，稱為式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。tracrRNA通過24個核苷酸與crRNA中的重復(fù)序列互補配對與形成雙鏈，引導(dǎo)Cas9到靶DNA。至此，天然CRISPR-Cas9干擾機制的拼圖基本拼搭完整^[12]。

CRISPR-CAS基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)

2012年Charpentier和Doudna團隊合作，不僅證明Cas9具有切割DNA雙鏈的能力，還能夠?qū)racrRNA和crRNA鏈接成sgRNA（single guide RNA），并在體外實驗中證實了sgRNA也可以指導(dǎo)Cas9蛋白完成對DNA的雙鏈剪切。他們可以通過改變crRNA的序列控制Cas9的靶向位點^[13]。隨后Siksnys團隊也報告了相同的發(fā)現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)不僅是細菌獲得性免疫系統(tǒng)領(lǐng)域的里程碑，更開啟了CRISPR-CAS基因編輯技術(shù)的新篇章。很快，2013年初的多篇論文都將CRISPR-Cas系統(tǒng)成功地應(yīng)用到了哺乳動物細胞中。其中，Church研究組設(shè)計了II型CRISPR-Cas系統(tǒng)，在人293T細胞、K562細胞以及誘導(dǎo)多能干細胞中通過設(shè)計sgRNA成功靶向特定序列，且多個gRNA可以實現(xiàn)對目標基因的多重編輯^[14]。張鋒實驗室證明了CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以在人類和小鼠細胞中進行精確的定點切割，并且將Cas9突變?yōu)槿笨诿?，促進同源修復(fù)過程^[15]。Qi研究組則建立了CRISPRi系統(tǒng)，還實現(xiàn)了多sgRNAs 靶向多基因 (Tet1、Tet2、Tet3、Sry 和Uty) 的同時定點突變^[16]。Wu等人利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對Crygc 顯性突變的小鼠進行基因治療使其獲得了健康的后代，為CRISPR-Cas9 系統(tǒng)用于遺傳疾病的基因治療提供了依據(jù)^[17]。

由此，CRISPR系統(tǒng)在多種生物的基因定點編輯、基因組篩選、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組成像、基因診療、生態(tài)應(yīng)用等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用開始井噴。隨后幾年，張鋒實驗室更將CRISPR-CAS的基因編輯系統(tǒng)進行了拓展，不僅發(fā)現(xiàn)了在特異性和多基因編輯方面都有著很大優(yōu)勢的CRISPR-Cas系統(tǒng)：CRISPR-Cpf1^[18]，還發(fā)現(xiàn)具有RNA酶功能的CRISPR酶Cas13a（C2c2）^[19]和Cas13b^[20]。2017年，有多篇文章研究了CRISPR-Cas13系統(tǒng)的作用機制、在臨床診斷中的應(yīng)用以及在哺乳動物細胞靶向RNA的能力。

3. CRISPR 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

CRISPR技術(shù)迅速發(fā)展使得它在轉(zhuǎn)化醫(yī)學和疾病治療領(lǐng)域中的應(yīng)用不斷創(chuàng)造出驚喜。2015年Science雜志發(fā)表了成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動物模型的方法。他們利用CRISPR系統(tǒng)編輯Dystrophin基因，能夠不同程度修復(fù)杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠的肌肉功能，從而達到治療DMD的效果^[21]。2018年有研究證實利用CRISPR技術(shù)成功治療了四只患有DMD（Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥）的狗，并將其肌肉和心臟組織中的營養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)到正常水平的92%^[22]。此外，CRISPR技術(shù)還與細胞免疫療法相結(jié)合以完善CAR-T療法，并在小鼠中增強了腫瘤抑制作用。首次利用CRISPR-Cas9在T細胞中敲除PD-1基因的臨床試驗已被批準用于治療肌肉浸潤性膀胱癌、去勢抵抗性前列腺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌和轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌，并在2016年開始了I期臨床試驗^[23]。

4. CRISPR的其他應(yīng)用

目前，CRISPR 并不止在基因組編輯得到了應(yīng)用，在基因檢測方面也展現(xiàn)了巨大的潛力。在2017年Science發(fā)表的研究中，Doudna 團隊發(fā)現(xiàn)了一個很有趣的現(xiàn)象：CRISPR 系統(tǒng)在剪切靶向的雙鏈 DNA 的同時，Cas12 的 DNA 酶活性會被激活^[24]。這個發(fā)現(xiàn)為檢測細胞內(nèi)是否含有某目的DNA 提供了一個全新的思路：同時向細胞內(nèi)遞送靶向該 DNA 的 CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)和非特異性 ssDNA 熒光報告基因（FQ-labeled reporter），一旦檢測到目的 DNA，CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)將啟動，與此同時，熒光報告基因也會被降解，從而釋放出熒光信號。利用這一技術(shù)，Doudna 團隊開發(fā)了DETECTR系統(tǒng)，能夠在一小時內(nèi)100%準確檢測出 HPV 16 感染，且單次測試成本不到一美元。與此同時，張鋒團隊也利用CRISPR-Cas13a開發(fā)出了SHERLOCK系統(tǒng)和SHERLOCKv2系統(tǒng)^[25]，與Doudna團隊不同，張鋒團隊設(shè)計的熒光報告基因必須是特異性，也正是“特異性”這個優(yōu)點使得 SHERLOCKv2 可以同時檢測多種序列。張鋒團隊還開發(fā)了類似驗孕棒的試紙檢測方法，只需一張試紙，SHERLOCKv2 就能顯示出病毒感染的檢測結(jié)果，這使得檢測更為便利。在今年COVID-19的檢測技術(shù)開發(fā)中，SHERLOCKv2也曾一顯身手。

雖然目前 DETECTR 和 SHERLOCK 已向我們展現(xiàn)出它們在診斷中的強大力量，但是在進入臨床使用前，為了確保診斷的準確性，研究者們?nèi)匀恍枰龃罅康墓ぷ?。我們相信這些新的診斷工具必將改寫未來的診斷技術(shù)，尤其是為那些衛(wèi)生條件相對較差、病毒高發(fā)的發(fā)展中國家在病毒感染診斷上帶來巨大的幫助。

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