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導(dǎo)讀

前列腺癌（PC）是一種發(fā)生于前列腺上皮的惡性腫瘤，是老年男性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。雄激素受體（AR）作為前列腺癌治療的重要靶點之一，其持續(xù)的下游信號傳導(dǎo)對前列腺癌細(xì)胞的生長、存活至關(guān)重要。AR結(jié)構(gòu)（圖1）主要由N末端轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域（NTD）、C末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）和中央DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）組成。AR-V7是一種AR剪切突變體，缺少LBD結(jié)構(gòu)域，在缺乏雄激素的條件下，AR-V7依然能誘導(dǎo)產(chǎn)生非配體依賴的轉(zhuǎn)錄，具備調(diào)節(jié)基因表達(dá)的活性，因此被認(rèn)為是剪切突變體中與去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）最相關(guān)的一種亞型。因此，開發(fā)能夠同時靶向AR及AR-V7的小分子藥物是治療常規(guī)與耐藥型前列腺癌的一種重要途徑。

近日，國際藥物化學(xué)領(lǐng)域TOP期刊 Journal of Medicinal Chemistry （DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00585）雜志報道中國海洋大學(xué)秦沖教授團(tuán)隊研究成果：提出靶向AT-NTD的PROTAC降解劑策略，設(shè)計并合成得到BWA-522可同時降解AR-FL（野生型）與AR-V7，并具有良好的口服效用，有望應(yīng)用于前列腺癌的治療。

正文

目前靶向AR的藥物（圖1）主要結(jié)合于LBD，如氟他胺（1）、比卡魯胺（2）、恩雜魯胺（3）和阿帕魯胺（4）。此外，一些靶向其他AR結(jié)構(gòu)域的拮抗劑也被報道，化合物5可高效靶向AR-DBD，其IC50 ~ 0.1 μM。EPI-002（6）是從海綿中分離出來的雙酚A衍生物，被證明通過結(jié)合AR-NTD來阻止AR轉(zhuǎn)錄活性。其前藥EPI-506（7）于2015年進(jìn)入I期臨床試驗，但因藥效不足，代謝水平較差，限制了其進(jìn)一步的臨床試驗。

圖1 AR及突變體蛋白結(jié)構(gòu)與AR拮抗劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖片來源：J. Med. Chem.)

蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）是另一種有前景的雙功能分子，它通過劫持細(xì)胞中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）來誘導(dǎo)靶蛋白的泛素化，隨后通過蛋白酶體降解（圖2）。雖然許多AR-LBD PROTAC（圖2）已經(jīng)成功地實現(xiàn)了AR的降解，但這些PROTAC針對AR-V7的降解效力仍然較弱。秦沖教授團(tuán)隊最近報道的AR拮抗劑-Hsp90抑制劑偶聯(lián)物，能同時誘導(dǎo)AR和AR-V7降解，并能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤靶向性，具備進(jìn)一步開發(fā)為候選藥物的潛力（J. Med. Chem. 2023, 66, 7, 4784–4801. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01970）。由于靶向AR-NTD的PROTACs能夠同時結(jié)合并降解AR-FL和AR-V7，消除其功能，在治療PC和CRPC中具備臨床價值。 綜上，研究人員開展了首個靶向AR-NTD的PROTAC設(shè)計、合成和生物學(xué)評價的研究。下載化學(xué)加APP到你手機(jī)，更加方便，更多收獲。

基于PROTAC分子結(jié)構(gòu)（圖3），研究人員選擇EPI-002作為靶蛋白配體，E3連接酶VHL與CRBN的配體作為招募E3配體，通過不同Linker將兩部分連接。為了在連接結(jié)構(gòu)時不影響配體結(jié)合效率，研究人員分析了NTD抑制劑EPI-002的結(jié)合方式（圖3），選擇處在溶劑暴露區(qū)的丙二醇片段作為接出位點，連接Linker與E3連接酶配體。

圖2 代表性AR PROTAC的化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖片來源：J. Med. Chem.)

圖3 AR-NTD PROTACs的設(shè)計(圖片來源：J. Med. Chem.)

在活性初篩階段，研究人員首先利用Click反應(yīng)，合成了三個具有不同長度Linker的AR-NTD PROTACs（13-15）。通過Western blotting分析LNCaP和VCaP中AR-FL和AR-V7蛋白水平。結(jié)果顯示（表1），化合物13-15在兩種前列腺癌細(xì)胞株中，僅能降低17.6-53.5%的AR-FL。

接下來，研究人員將E3連接酶配體換為沙利度胺，設(shè)計合成了具有柔性和半剛性Linker的PROTACs（16-24）。降解數(shù)據(jù)顯示（表2），基于CRBN配體的PROTACs相比于VHL配體對AR-FL與AR-V7的降解活性更高，其中含有半剛性Linker的化合物 24的降解活性最強(qiáng)，1 μM和5 μM化合物在VCaP細(xì)胞中可誘導(dǎo)AR-FL分別降低22.6%和49.3%，AR-V7分別降低54.4%和75.7%。

表1. 柔性Linker的VHL配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

表2. 柔性與半剛性Linker的CRBN配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

剛性Linker的構(gòu)象限制有助于PROTACs形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物，從而顯著提高降解活性。因此，研究人員利用四元或六元雜環(huán)片段設(shè)計了具有剛性Linker的化合物25-34（表3）。在LNCaP細(xì)胞中，化合物28（BWA-522）在1 μM和5 μM下分別降低了48.7%和72.0%的AR-FL。而在VCaP細(xì)胞中，BWA-522對AR-FL和AR-V7的顯示出較強(qiáng)降解活性，在1 μM和5 μM下誘導(dǎo)AR-FL和AR-V7分別降低了52.4、73.1%和77.3、84.6%。

最后，研究人員將化合物25-34中沙利度胺的苯環(huán)的連接位置從間位改為鄰位，合成了化合物35-44（表4）。Western blotting結(jié)果顯示， LNCaP細(xì)胞中，這些化合物誘導(dǎo)AR-FL蛋白水降解效果大多優(yōu)于相應(yīng)的間位取代化合物。活性最高化合物39在LNCaP細(xì)胞中分別誘導(dǎo)降低了13.9%（1 μM）和62.4%（5 μM）的AR-FL。在VCaP細(xì)胞中，給藥濃度1 μM和5 μM時，39誘導(dǎo)AR-FL分別降低44.3%和57.2%，誘導(dǎo)AR-V7分別降低37.1和72.7%。

表3. 剛性Linker的CRBN配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

表4. 不同取代位置剛性Linker的CRBN配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

研究人員選擇初篩活性較好的的化合物24、BWA-522與39在小鼠中進(jìn)行PK測試（表5）。經(jīng)2 mg/kg靜脈給藥后，化合物BWA-522的AUC最高為3018 h·ng/mL，且血漿清除率較低為594 mL/h/kg。同時，研究人員還比較了三個化合物口服效率，發(fā)現(xiàn)化合物BWA-522具有極好的口服血漿暴露，AUC值為5947 h·ng/ml，優(yōu)于化合物24與39。化合物BWA-522的口服生物利用度為40.5%，而化合物24和39的口服生物利用度分別僅為7.8%和12.3%。

表5. 化合物24、BWA-522和39在小鼠體內(nèi)的PK數(shù)據(jù)(圖片來源：J. Med. Chem.)

鑒于BWA-522在小鼠中的良好口服利用度，我們進(jìn)一步評估了其在比格犬中的PK（表6）。當(dāng)口服劑量為5 mg/kg時，BWA-522的t1/2為31.2 h，口服生物利用度為69.3%。這些結(jié)果共同表明BWA-522是一種具備口服活性PROTAC分子。

表6. 化合物BWA-522在比格犬體內(nèi)的PK數(shù)據(jù)(來源：J. Med. Chem.)

研究人員選擇BWA-522在LNCaP、VCaP和22Rv1三種前列腺癌細(xì)胞系進(jìn)行詳細(xì)的Western blotting檢測。其中22Rv1是一種CRPC細(xì)胞系，并對恩雜魯胺耐藥。結(jié)果顯示（圖4），BWA-522顯著降低了3種細(xì)胞系中AR-FL和AR-V7的水平，并呈現(xiàn)出良好的時間與劑量依賴性。BWA-522誘導(dǎo)LNCaP、VCaP和22Rv1細(xì)胞中AR-FL蛋白降解，其DC50分別為3.45、0.73和2.41 μM（圖4D）。它在VCaP和22Rv1細(xì)胞中也實現(xiàn)了AR-V7蛋白的高效降解，其DC50分別為0.67和0.76 μM（圖4E）。

圖4 前列腺癌細(xì)胞系A(chǔ)R-FL或AR-V7蛋白的Western blotting分析(圖片來源：J. Med. Chem.)

接下來，研究人員研究BWA-522在前列腺癌細(xì)胞系中的降解機(jī)制。在BWA-522處理前，分別用蛋白酶體抑制劑MG132（3 μM）、活化E1酶抑制劑MLN4924 （1 μM）和CRBN配體沙利度胺（100 μM）預(yù)處理細(xì)胞。結(jié)果顯示BWA-522降解效果明顯減弱（圖5），證明BWA-522對AR-FL和AR-V7的降解依賴細(xì)胞中的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。

圖5 BWA-522降解AR-FL及AR-V7的作用機(jī)理(圖片來源：J. Med. Chem.)

AR及其變體在調(diào)節(jié)AR依賴性前列腺癌細(xì)胞的增殖中起著至關(guān)重要的作用，因此研究人員測試了BWA-522在LNCaP、VCaP和22Rv1細(xì)胞中的抗增殖能力。如圖6所示，BWA-522在LNCaP和VCaP細(xì)胞中的IC50值分別為1.07和5.59 μM。同時，BWA-522能有效抑制恩雜魯胺耐藥細(xì)胞22Rv1的生長，IC50值為4.08 μM。研究人員還在LNCaP和22Rv1細(xì)胞系中進(jìn)行了克隆形成實驗，以評估藥物對細(xì)胞增殖的長期抑制作用。與細(xì)胞增殖抑制測定結(jié)果一致，BWA-522以劑量依賴的方式減少了這兩種細(xì)胞系的集落形成（圖7）。

圖6 BWA-522對前列腺癌細(xì)胞的抗增殖活性(圖片來源：J. Med. Chem.)

圖7 BWA-522抑制前列腺癌細(xì)胞的克隆形成(圖片來源：J. Med. Chem.)

為了研究對AR信號通路的影響，研究人員測試了BWA-522在LNCaP（圖8A）和VCaP（圖8B）細(xì)胞中能否抑制AR下游蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示BWA-522能劑量依賴性地抑制兩種細(xì)胞系TMPRSS2、FKBP51和PSA蛋白水平。

圖8 BWA-522對AR信號通路的影響(圖片來源：J. Med. Chem.)

研究人員評估了口服BWA-522對LNCaP異種移植腫瘤模型小鼠的抗腫瘤呢能力。結(jié)果顯示（圖9），兩種給藥劑量的BWA-522均能有效抑制腫瘤的生長。治療結(jié)束時，與對照組相比，口服20和60 mg/kg BWA-522對腫瘤生長的抑制作用分別為26%和76%，表現(xiàn)出優(yōu)于AR拮抗劑EPI-002（180 mg/kg，PO）的腫瘤抑制活性。此外，研究人員還進(jìn)行了BWA-522毒理研究，以評估其在ICR小鼠中的潛在副作用。BWA-522以20和60 mg/kg的劑量每日口服給藥，連續(xù)14天。在治療結(jié)束時，兩劑量組均未觀察到明顯的動物體重減輕或器官損傷，表明BWA-522在體內(nèi)具有良好的體內(nèi)耐受性。

最后，研究人員評估了BWA-522體外一些成藥特性。結(jié)果顯示，該化合物在人或鼠的肝微粒體與血漿中都保持了較好的穩(wěn)定性，并無明顯hERG毒性。

圖9 BWA-522對LNCaP異種移植瘤模型小鼠的抗腫瘤活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

總結(jié)

綜上，秦沖教授課題組發(fā)現(xiàn)的化合物BWA-522，是一種有效的口服生物可利用的AR-NTD PROTAC降解劑，有望成為治療AR-FL和AR-V7依賴性腫瘤的候選藥物。

該工作特別致謝中國海洋大學(xué)和青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室的支持。中國海洋大學(xué)博士研究生張博聞，碩士研究生劉暢、楊振乾和工程師張賽為該論文共同第一作者，秦沖教授為通訊作者。該工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金及山東省自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金等項目的資助。

課題組簡介

課題組研究方向為：

（1）基于靶向蛋白降解（PR OTACs）策略的小分子先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)和新藥發(fā)現(xiàn)；

（2）去勢抵抗性前列腺癌治療藥物研究；

（3）海洋天然活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)多樣性修飾及成藥性優(yōu)化。

課題組近期成果介紹：

（1）秦沖教授團(tuán)隊聯(lián)合浙江大學(xué)藥學(xué)院高建青教授團(tuán)隊設(shè)計制備了一種載有雄激素受體PROTAC化學(xué)藥物的微針貼片，通過降解毛囊內(nèi)的雄激素受體來實現(xiàn)毛發(fā)再生。

在AGA治療實驗中，與每日使用的陽性對照米諾地爾相比，該微針貼片只需一次給藥即可達(dá)到質(zhì)量相當(dāng)?shù)拿l(fā)再生，且再生速度更快。同時該微針在停藥后仍能維持藥效，在再復(fù)發(fā)模型上仍能實現(xiàn)高質(zhì)量的毛發(fā)再生，有望克服臨床治療手段停藥后易復(fù)發(fā)的缺陷。 （Small Methods, 2023, 7(1):e2201293. doi: 10.1002/smtd.202201293. IF=14.188）

（2）秦沖教授團(tuán)隊評估了新型BET降解劑QCA570在多種膀胱癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，并探討其潛在機(jī)制。

QCA570在納摩爾濃度下可誘導(dǎo)BRD4蛋白降解，其DC50約為1 nM。QCA570可以通過轉(zhuǎn)錄抑制和誘導(dǎo)靶蛋白降解進(jìn)而降低EZH2和c-MYC表達(dá)水平。此外，QCA570顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯，對膀胱癌細(xì)胞具有潛在療效。 （Front Chem, 2023, 11:1 121724. doi: 10.3389/fchem.2023.1121724. IF=5.545）

（3）秦沖教授團(tuán)隊報道了一類新型AR拮抗劑-Hsp90抑制劑偶聯(lián)分子的最新研究進(jìn)展，該分子不僅可以提升藥物的腫瘤靶向，減少不必要的毒副作用，還可以通過AR和Hsp90的雙靶點協(xié)同抑制，達(dá)到提升藥效和克服CRPC耐藥的目的。（J. Med. Chem. 2023, 66, 7, 4784–4801. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01970. IF=7.3）

導(dǎo)師介紹

秦沖博士 ，中國海洋大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，青島海洋生物醫(yī)藥研究院副院長。2010年畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)專業(yè)，獲學(xué)士學(xué)位；2015年畢業(yè)于北京大學(xué)藥物化學(xué)專業(yè)，獲博士學(xué)位（導(dǎo)師：焦寧教授）；2016-2019年在美國密歇根大學(xué)從事博士后研究（導(dǎo)師：王少萌教授）；2019年回國后在中國海洋大學(xué)獨立開展研究工作，主持國家高層次青年人才項目（2021）、國家重點研發(fā)計劃青年科學(xué)家項目（2022）、國家自然基金青年基金（2021）、山東省“泰山學(xué)者”青年專家（2020）、山東省自然基金優(yōu)秀青年基金（2021）等研究項目，獲北京市自然科學(xué)獎一等獎（2019）。

近年來在 J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Small. Methods.、 J. Med. Chem. 等雜志發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇，申請國際發(fā)明專利十余項。

聯(lián)系方式：qc@ouc.edu.cn。

文獻(xiàn)詳情：

Bowen Zhang, Chang Liu, Zhenqian Yang, Sai Zhang, Xiaolin Hu, Baohu Li, Mei Mao, Xiao Wang, Zhuoyue Li, Shumin Ma, Siqi Zhang, and Chong Qin*. Discovery of BWA-522, a First-in-Class and Orally Bioavailable PROTAC Degrader of the Androgen Receptor Targeting N-Terminal Domain for the Treatment of Prostate Cancer. J. Med. Chem.2023,https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00585