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羅丹明染料具有優(yōu)異的光物理性能、結(jié)構(gòu)-性質(zhì)可調(diào)性以及良好的生物性而被廣泛應(yīng)用于生物靶向和熒光標(biāo)記等領(lǐng)域。羅丹明染料結(jié)構(gòu)中存在著親脂性內(nèi)酯（L）和兩性離子（Z）平衡。通過(guò)確定K_L-Z的平衡常數(shù)可以優(yōu)化羅丹明染料的生物性能（Figure 1a）。近期研究表明苯環(huán)的氟化可以提升含氮雜環(huán)丁烷羅丹明染料的K_L-Z。此外，作者還發(fā)現(xiàn)氟化苯環(huán)可以更簡(jiǎn)便地合成羅丹明染料衍生物，該方法中采用了含甲氧基甲基醚（MOM）保護(hù)基的2-羥基丙二腈MAC試劑（Figure 1b）。作者通過(guò)調(diào)研羅丹明染料的合成路線，進(jìn)而發(fā)展了制備氟化羅丹明的新方法。通過(guò)修飾不同的助色團(tuán)取代基，能夠顯著影響內(nèi)酯-兩性離子平衡，并進(jìn)一步影響化合物性質(zhì)。最后，所制備的染料還被成功證明可用于先進(jìn)光學(xué)成像當(dāng)中。下載化學(xué)加APP到你手機(jī)，更加方便，更多收獲。

作者考察了在二氧六環(huán)-和水的體系中不同染料內(nèi)部的內(nèi)酯-兩性離子平衡（Figure 2）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明氟化過(guò)程一般會(huì)增大K_L-Z，該常數(shù)與染料結(jié)構(gòu)中的橋聯(lián)取代基團(tuán)密切相關(guān)。因此，根據(jù)助色團(tuán)的給電子能力大小（NH₂ < azetidine < pyrrolidine <tetrahydroquinoline < julolidine），SiRh₁₁₀和 JF₆₄₆  的K_L-Z ~ 10^?3, JFX₆₅₀ 和SiRhQ的 K_L-Z ~ 10^?2, 含 julolidine 基團(tuán)的SiRh₁₀₁的K_L-Z ~1。

接下來(lái)，作者選擇三種氟化染料進(jìn)行后續(xù)的生物成像應(yīng)用研究。作為ATTO 647N（115，F(xiàn)igure 3a）染料的氟化類似物，carborhodamine 59與其進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。ATTO 647N-HaloTag用于活細(xì)胞成像時(shí)，并未實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞核的顯著標(biāo)記（Figure 3b），而這也歸因于陽(yáng)離子羅丹明染料的衍生物更傾向于聚集在活細(xì)胞中的線粒體上。作者將染料59_HTL與表達(dá)組蛋白H2B?HaloTag融合蛋白的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從圖中可以看出59_HTL對(duì)細(xì)胞核的染色效果良好（Figure 3c）。此外，作者還比較了59_HTL和89_HTL在單顆粒示蹤（SPT）實(shí)驗(yàn)中的成像性能表現(xiàn)（Figure 3d）。從Figure 3e中可以看出，59_HTL的亮度較高（Figure 3e）。同時(shí)，89_HTL隨著成像時(shí)間的延長(zhǎng)，光漂白的速度較快（Figure 3f）。

近紅外窗口具有背景熒光干擾性小、低散射、相對(duì)較大的組織穿透深度等優(yōu)點(diǎn)。作者對(duì)比了31_HTL和包括31_HTL、38_HTL等在內(nèi)的近紅外熒光探針的光學(xué)性能（Figure 4a）。通過(guò)調(diào)整合成方法進(jìn)而得到近紅外激發(fā)的染料110（Figure 4b）。作者繼續(xù)測(cè)試了該染料在活細(xì)胞標(biāo)記成像當(dāng)中的實(shí)用性。所有的化合物都可以與表達(dá)HaloTag的活細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行靶向，然而在相同激發(fā)波長(zhǎng)下，31_HTL展現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度（Figure 4c）。同時(shí)，相較于107_HTL和106_HTL，31_HTL展現(xiàn)出良好的光學(xué)穩(wěn)定性和更高的亮度，因而可以實(shí)現(xiàn)多色成像（Figure 4d）。

最后，分子 65_HTL與HaloTag 蛋白進(jìn)行孵育后的吸光度提升了47倍（Figure 5a, b）。作者將遠(yuǎn)紅外淬滅染料作為半合成傳感器用于標(biāo)記cAMP。染料與cAMP結(jié)合后的構(gòu)象發(fā)生改變，從而削弱FRET過(guò)程，使得受體的熒光壽命提高（Figure 5c, d）。FRET過(guò)程的構(gòu)建是以65_HTL作為受體，88_STL作為給體?；跓晒鈮勖@微鏡（FLIM），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明細(xì)胞的壽命為 2.34 ± 0.10 ns（Figure 5d, e）。該數(shù)據(jù)顯著低于只用JFX612給體標(biāo)記的細(xì)胞壽命（4.30 ± 0.01 ns），由此表明JQ645-HaloTag是FRET過(guò)程的淬滅劑。此外，使用forskolin（腺苷酸環(huán)化酶激活劑）增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度后會(huì)使染料分子的壽命提高至3.32 ± 0.18 ns，證明JQ645-HaloTag可被用作為自標(biāo)記探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物。